制藥用水系統是制藥行業(yè)所需的潔凈公用工程系統。制藥用水可以作為清潔劑，用于淋洗和清潔儲罐、設備等，或作為原輔料，用于藥品調配、合成與制劑生產(chǎn)，也可作為高壓滅菌器的蒸汽供應等。制藥用水的化學(xué)純度和微生物負荷會(huì )直接影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量，每家制藥企業(yè)都會(huì )投入大量的資源建設和維護制藥用水系統。

根據生產(chǎn)工藝和應用場(chǎng)景的不同，藥品生產(chǎn)工藝中使用的水，主要分為飲用水、純化水、注射用水和滅菌注射用水。雖然每一級水都有嚴格的質(zhì)量控制體系，但是每一級水也都是微生物污染的潛在來(lái)源，因此，制藥用水系統微生物負荷的控制尤為關(guān)鍵。在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中，為了更好地控制制藥用水系統中的微生物水平，除了通過(guò)生物負載測定微生物數量外，微生物學(xué)家還需要了解水系統中存在的微生物類(lèi)型，不僅有助于明確水系統中微生物污染趨勢的變化，也便于預測它們是否會(huì )導致更嚴重的問(wèn)題，比如水系統中是否有形成生物被膜的風(fēng)險，或者它們是否對產(chǎn)品(從而對患者)造成特殊風(fēng)險。

本文對制藥用水系統中主要的微生物類(lèi)型及其風(fēng)險因素進(jìn)行綜述，以期為制藥企業(yè)水系統的微生物控制提供幫助。

1、純化水微生物群落結構

純化水為飲用水經(jīng)蒸餾法、離子交換法、反滲透法或其他適宜的方法制備的制藥用水，不含任何附加劑。純化水可作為配制普通藥物制劑用的溶劑或試驗用水，也可作為中藥注射劑、滴眼劑等滅菌制劑所用飲片的提取溶劑等。有人員從6300 個(gè)純水樣本篩選到315個(gè)超警戒線(xiàn)的樣本，并回收了 347 個(gè)分離株。純化水微生物中主要的屬為 Ralstonia（羅爾斯通菌屬）和 Burkholderia（伯克霍爾德菌屬）， 而 Ralstonia pickettii （皮氏羅爾斯通氏菌）和Burkholderia cepacia （洋蔥伯克霍爾德氏菌）為純化水中最主要的菌種。

2、注射用水微生物群落結構

注射用水為純化水經(jīng)蒸餾所得的水，需符合細菌內毒素試驗要求。制藥企業(yè)應定期清洗與消毒注射用水系統。注射用水的儲存方式和靜態(tài)存儲期限應經(jīng)過(guò)驗證確保水質(zhì)符合質(zhì)量要求。注射用水可作為配制注射劑、滴眼劑等溶劑或稀釋劑及容器的精洗。由于注射用水嚴格的質(zhì)量控制，通常從注射用水系統中分離的微生物很少。如果水系統的管道設計可有效避免所謂的“死角”(水流中斷的區域)并且水流保持連續運動(dòng)狀態(tài)，則污染風(fēng)險會(huì )進(jìn)一步降低。有人員在15年間收集了46800 個(gè)注射用水樣本。研究發(fā)現，很少有注射用水樣品不滿(mǎn)足水系統的質(zhì)量要求。46800 個(gè)樣本中只有300 個(gè)樣本檢測到革蘭氏陰性桿菌(比率為 0.6%)，最終回收了439 個(gè)革蘭氏陰性桿菌(每個(gè)樣本少于2種不同的生物體)。數量上最常見(jiàn)的微生物種名還是Ralstonia pickettii （皮氏羅爾斯通氏菌）和Burkholderia cepacia （洋蔥伯克霍爾德氏菌）。

3、制藥用水中主要的微生物及其危害性分析

洋蔥伯克霍爾德菌復合體 (Burkholderiacepacia complex，BCC)和皮氏羅爾斯通菌是制藥用水中主要的污染菌。

3.1 BCC

BCC因引起洋蔥患病而得名，實(shí)際上它可以感染植物界及人類(lèi)，具有較強跨界感染能力，可以使患有囊性纖維化和慢性肉芽腫性疾病的患者引起嚴重的“洋蔥伯克氏菌綜合癥”致死。免疫功能低下患者(虛弱的老年人、HIV 陽(yáng)性者、接受化療的癌癥患者等)中也有該菌感染的報道[8]。2007 年發(fā)表的一份調查報告顯示，在 1998 年~2006 年FDA 非無(wú)菌藥品微生物污染召回事件中，占 22%的污染微生物為洋蔥伯克霍爾德菌，污染藥品類(lèi)型包括：痤瘡膏、糖漿、吸入液、非酒精身體噴霧劑、嬰兒油、洗發(fā)水和漱口水。2004 年~2011年，有 34%的產(chǎn)品召回與該菌的污染有關(guān)。2012年~2019 年的 FDA 召回事件表明，洋蔥伯克霍爾德菌是非無(wú)菌藥物微生物污染召回的頭號原因(占45.3%，共發(fā)生 102 次召回)。這些召回事件引起了美國藥典委員會(huì )的重視，并特別發(fā)布 USP<60>非無(wú)菌產(chǎn)品的微生物學(xué)檢查：伯克霍爾德菌復合物，以檢測非無(wú)菌產(chǎn)品中是否存在 BCC 物種。

BCC 之所以是制藥行業(yè)主要的不可接受微生物，主要原因是由于它具備以下能力：①能在寡營(yíng)養和低滲透壓的純水環(huán)境生存的能力。保持完整外膜結構的能力與該菌在水環(huán)境中長(cháng)期存活有關(guān)。在營(yíng)養缺乏時(shí)，形態(tài)從典型的革蘭氏陰性桿菌轉變?yōu)榍蚓?，并可進(jìn)入休眠狀態(tài)活著(zhù)但不可培養。該階段細胞代謝活性降低，膜脂成分改變，導致外膜通透性降低，從而增加對多黏菌素B的耐受性。此外，大多數基因表達水平降低，而氨基酸、脂肪酸和磷脂代謝基因表達水平增加，這表明這些化合物可以在營(yíng)養缺乏的情況下替代碳源和能源。②BCC具備可以在多種藥物中生長(cháng)和增殖能力。BCC 細菌能夠使用多種有機化合物作為碳源和能源，其中一些是很難分解代謝的外源性物質(zhì)[14]。例如，它們能夠通過(guò)對芳香結構氧化并對鹵化化合物進(jìn)行分解，從而在硝基芳香族和芳香族化合物中生存，可導致藥品活性成分的降解，從而影響藥物的穩定性和純度，以及它們的效力和有效性[15]。藥物降解還可能導致有毒物質(zhì)的形成[16]。最終對這類(lèi)產(chǎn)品的消費者構成了嚴重的風(fēng)險。③對細菌抑制劑、抗生素有強大的耐受機制的能力。它們可以通過(guò)形成生物被膜、耐藥基因等方式抗逆。

3.2皮氏羅爾斯通菌

通過(guò)分析 2012 年~2019 年的 FDA 召回報告發(fā)現，羅氏菌(占總召回數的 20%，共發(fā)生 45 次召回)排在洋蔥伯克霍爾德菌之后，是非無(wú)菌藥物微生物污染召回的第二大原因。

皮氏羅爾斯頓菌不被認為是主要病原體，它的毒力也較低，但它引起的感染報導屢見(jiàn)不鮮，包括血流感染、腦膜炎和瘧原蟲(chóng)體外培養污染等。許多皮氏羅爾斯頓菌感染病例是由于受污染的溶液引起的，包括注射用水、用純化水制成的鹽水溶液和無(wú)菌藥物溶液。這些藥物可以靜脈注射和作為滴注液，用于清潔傷口或用于氣管內吸痰，從而導致血液(菌血癥)和呼吸道感染。而這些溶液產(chǎn)品的污染最大可能是發(fā)生在制造階段。過(guò)濾器往往用于一些藥物的終端滅菌，但皮氏羅爾斯頓菌能夠通過(guò) 0.45µm 和 0.22µm 的濾膜，從而使得終產(chǎn)品染菌。在1983 年，5名嬰兒因為使用了受皮氏羅爾斯頓菌污染的呼吸治療溶液而被感染，而這正是由于蒸餾水的生產(chǎn)過(guò)程中繞過(guò)了一個(gè) 82 ℃的儲槽，使得該菌活著(zhù)進(jìn)入了溶液。此外，該菌也能在醫院消毒劑中存活，包括洗必泰和乳酸依沙吖啶。

盡管皮氏羅爾斯通菌毒力很低，但正如上文所提及的該菌已被確定為會(huì )導致許多潛在的有害感染和死亡。因此，制藥用水中尤其要控制此菌的污染。

4、制藥用水系統的微生物控制措施

即使藥企對制藥用水系統進(jìn)行嚴格的控制，還是有很小數量微生物存在于各個(gè)級別的用水系統中。此外，制藥企業(yè)對于水系統的微生物檢測也有不足之處，主要有：①水中的微生物分布遵循泊松分布而非均勻分布，這使得水體微生物的回收率往往重復性不佳；②培養條件的限制。培養基的選擇性和培養時(shí)長(cháng)的受限，都會(huì )影響水體中微生物的回 收率。如受 培養基的選擇性，Prosthecate bacteria( 柄桿菌 ) ，Mycobacteriumspecies( 分枝桿菌 ) ， Spirochaetes( 螺旋體 ) ，Thiobacillus species(硫桿菌屬)等種類(lèi)很難被培養；③采樣方式的局限性。目前的采樣大多針對自由漂浮狀態(tài)的微生物，而不是對附著(zhù)在底層的微生物或生物膜群落的部分進(jìn)行檢測；④制藥用水是一個(gè)營(yíng)養及其缺乏的極端環(huán)境，絕大多數的微生物以“活著(zhù)但不可被培養”或者生物被膜的狀態(tài)存在，因此目前藥企的培養結果也僅占水系統微生物的小部分。

正是由于微生物在制藥用水系統中的不確定性，制藥企業(yè)的微生物專(zhuān)家需要考慮和了解水系統中的微生物的不斷變化的模式，開(kāi)展一系列的工作，包括：①建立各級水系統的微生物數據庫。對構成不同水系統微生物常見(jiàn)分離株進(jìn)行鑒定，并了解不同水質(zhì)之間是否存在關(guān)系。②建立趨勢分析的方法?？梢赃B續幾年對水系統中的微生物數據進(jìn)行比較和趨勢分析，檢查微生物的種類(lèi)是否與預期在水系統中發(fā)現的微生物相似，同時(shí)能夠對趨勢的任何變化作出及時(shí)的響應。③收集并建立水系統常見(jiàn)的微生物菌種庫，用于培養基驗證、消殺驗證等。

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